TP les tests immunologiques

« CAHIER DE LABORATOIRE : LES TESTS IMMUNOLOGIQUES 2021-2022 1 sur 17 TABLE DES MATIERES Introduction des différentes techniques p.3 Séance 1 : ELISA → Mise en place du complexe hCG-anticorps Exercice 1 : Préparation et fixation d’anticorps antihCG dans les puits. p.3 Exercice 2 : Fixation des antigènes hCG p.4 Séance 1 : Mancini → Préparation du gel d’agar/anticorps antiHGC, mise en réaction dans les puits de standards et de l'échantillon test p.4 Exercice 1 : Préparation du gel p.4 Séance 2 : Test de grossesse → Comprendre son fonctionnement p.6 Séance 2 : Mancini → Analyse des échantillons p.7 p.7 Exercice 2 : Observer et analyser les résultats obtenus Séance 2 : ELISA → Mise en place du complexe anticorps-antigène-anticorps + analyse des résultats p.8 Exercice 3 : Préparation de la solution d’anticorps conjugué p.8 Exercice 4 : Fixation des anticorps anti-hCG marqués avec l’enzyme Alk p.8 p.8 p.9 Exercice 5 : Préparation d’une solution de PNPP + distribution de la solution Exercice 6 : Mesure de l’absorbance + analyse des résultats Conclusion 2 sur 17 p.11 3 sur 17 Mercredi 02 mars 2022 Début de 2 expériences sur 5 échantillons qui sont les tests urinaires de 3 sportifs et 2 femmes possiblement enceintes. L’objectif de nos expériences est de savoir grâce à la présence ou non d’hCG dans les tests urinaires de nos 5 échantillons si les 2 femmes sont enceintes et si les sportifs se dopent. Pour se faire nous utiliserons 3 types de tests différents : le test ELISA, le test Mancini et un test de grossesse accessible en pharmacie. Ici, nous utiliserons le test ELISA en sandwich.

Cette technique est dite quantitative . Elle consiste à isoler une protéine recherchée ici hCG entre 2 types d’anticorps dirigés contre elle mais reconnaissants des épitopes différents. On fixe d’abord les deux types d’anticorps sur un support, on incube ensuite notre échantillon avec les anticorps fixés.

Enfin on rajoute les deux types d’anticorps couplé à une enzyme dans le support afin reconnaitre le complexe dans notre cas hCG anticorps .

On a donc notre hCG qui se retrouve entre 2 anticorps prise en « sandwich ».

Suite à cette manipulation nous utiliserons un spectrophotomètre afin de connaitre l’absorbance de chaque échantillon avec en comparaison des standards dont la concentration en hCG est déjà connue. Pour le test Mancini, cest un test dit quantitatif.

La technique de Mancini ou test d’immunodiffusion radiale simple repose sur la formation de complexes immuns (complexe spécifique antigène-anticorps) en utilisant une plaque recouverte d'une gélose à hauteur constante dans laquelle est mélangé un sérum contenant des anticorps anti-antigène.

L’intérêt général de cette manipulation est de montrer que l’on peut non seulement détecter mais aussi doser un antigène dans une solution. Nous préparons une solution qui formera un gel d’agar à 1% au quel sera incorporé 100μL d’anticorps antiHGC, ainsi les anticorps seront contenus dans le gel.

Suite a quoi des standards ( dont nous connaissons la concentration en hCG ) ainsi que l'échantillon à tester seront ajoutés dans des puits préalablement réalisés.

Finalement après incubation nous pouvons normalement constater des halos d’immunoprécipitations ce qui nous permettra d’établir la concentration de notre échantillon. Dans notre cas, 10 binômes ont réalisés les mêmes expériences avec comme variable les échantillons étudiés.

Notre binôme s’est occupé de deux échantillons : YC et DC pour les manipulations concernant la technique d’ELISA et nous avons interprétés les résultats de l’échantillon YC. Séance 1 : ELISA → Mise en place du complexe hCG-anticorps Exercice 1 : Préparation et fixation d’anticorps anti-hCG dans les puits. Objectif : Préparer et fixer les anticorps anti-hCG Protocole expérimental : Détail de l’expérience : Manipulations effectuées la vieille par un / une technicien(ne) 4 sur 17 1. 1.1.Préparation de l’anticorps de capture : Dans 10mL de tampon de revêtement au carbonate, ajouter 50μL d’anticorps de capture concentré ( dans un récipient d’un matériau qui ne fixe pas les anticorps comme le verre ) 1. 1.1.Pipeter 100μL de la solution obtenue dans chaque puit ( 8 puits : 3 pour YC, 3 pour DC, 1 standard, 1 blanc ) Les 2 échantillons sont effectués plusieurs fois pour éviter les erreurs 1. 1.1.Incuber les puits dans une boite humide toute la nuit au réfrigérateur à 4°C après les avoir mis sur une plaque ( cette étape d’incubation permet au anticorps de fixer les puits ) Schéma explicatif du positionnement des puits : YC F DC D G A YC C B YC E 0 S DC DC H Exercice 2 : Fixation des antigènes hCG Objectif : Fixer les antigènes hCG des échantillons aux anticorps anti-hCG fixés dans les puits Protocole expérimental : Détail de l’expérience : Manipulations effectuées par TANDRAYEN Ségolène et PITOU Rafaël 1. 1.1.Après avoir récupérer les puits incubés, les vider et les remplir avec du 1X PBST.

Répéter l’opération 4 fois supplémentaires ( taper la plaque contenant les puits à l’envers sur un papier jusqu’à disparition d’un maximum de bulles ) 5 sur 17 Cette étape permet dans un premier temps en nettoyant avec du 1X PBST d’éliminer les anticorps anti-hCG non fixés aux puits.

L’élimination des bulles d’air dans les puits est importante pour que lors de la spectrophotométrie il n’y ait pas d’erreur. Dans notre cas quelques bulles n’ont pas été éliminés dans les puits B et C 1. 1.1.Distribuer 100 μL de chaque échantillon correspondant dans les bons puits comme vu sur le schéma explicatif du positionnement des puits ci-dessus. Lors de cette étape, les potentiels antigène hCG sont mis en contact avec des anticorps anti-hCG fixés des puits. 1. 1.1.Incuber la plaque contenant tous les puits toute la nuit dans le réfrigérateur à 4°C Cette étape permet la formation de complexe anticorps hCG- antigène hCG si ces derniers sont présents dans les différents échantillons distribués Séance 1 : Mancini → Préparation du gel d’agar/anticorps antiHGC, mise en réaction dans les puits de standards et de l'échantillon test Exercice 1 : Préparation du gel Objectif : Préparer un gel contenant des anticorps dans lequel on pourrait créer par la suite des puits pouvant accueillir nos différents échantillons . Protocole expérimental : Manipulations effectuées par un / une technicien(ne) 1.

Allumer le bain marie avant le début de l’expérience et vérifier qu’il soit correctement réglé sur 56°C pour qu’il ait le temps de chauffer. 2.

Préparer pour l’ensemble des binômes 300 mL de gel à 1% d’Agar avec la solution tampon.

Mettre à tempérer à 56°C au bain-marie avec un anneau lesteur de cette façon l’erlen restera non seulement stabilisé mais immergé pour que ce dernier puisse rester liquide car pour cela il est nécessaire que la température soit ni trop chaude ni trop froide. Manipulations effectuées par TANDRAYEN Ségolène et PITOU Rafaël 1.

Ajouter dans le tube à hémolyse 100 μL d’anticorps anti-hGC, préalablement conservé à 4°C pour éviter sa dégradation qui est rapide a température ambiante. 2.

Compléter ce même tube avec la solution d’agar jusqu’au trait de solution tracé au préalable indiquant la quantité d’agar nécessaire . 3.

Découper un bout de parafilm qui permettra de bien maintenir fermé le tube a hémolyse à l’aide du pouce en vue d’homogénéiser l’anticorps et la solution en retournant le tube.

Le parafilm permet qu’il n’y ait aucune fuite lors de l’étape d’homogénéisation de la solution. 6 sur 17 4.

Verser la totalité du mélange agar/anticorps dans la boite de pétri, afin de réaliser une couche homogène et horizontale cette dernière sera laissée sur un plan horizontal sans être touchée quelques minutes le temps qu’elle se solidifie.

De cette façon à ce que les anticorps soit contenus dans le gel de façon homogène. 5.

Lorsque le mélange agar/anticorps est bien figé, réaliser 4 puits de 2,5 mm de diamètre à l’aide d’une pipette plastique de 2 mL munie d’une poire, les puits seront espacés le plus possible les uns des autres et à 1cm du bord.

Les découpes de puits dans l’agar doivent être le plus nette possible et dépourvue de bords rugueux, afin de permettre aux anneaux blancs ( halos ) qui montreront une immunoprécipitation de se former correctement. Dans notre cas les bords de nos puits n’étaient pas très nette malgré un entrainement préalable sur gélose.

Mais notre expérience n’ayant pas fonctionné suite à un supposé biais de température ( voir plus bas détails ) cela n’a pas affecté nos résultats 6.

Déposer 9 μL des 3 standards les plus concentrés dans 3 puits identifiés.

Et déposer 9 μL de l’échantillon à tester dans le dernier puit de la première boite de pétri.

Dans l’autre boîte, déposer 9 μL des 3 standards les moins concentrés dans 3 puits identifiés et enfin déposer 9 μL de l’échantillon à tester dans le dernier puit de la seconde boite. Schéma explicatif du positionnement des puits dans les deux géloses : YC YC 7 sur 17 M1 M2 88 M2 M3 M3 M4 7.

Après avoir laissé les échantillons dans l’agar, transférer délicatement les géloses sur un support humide dans une boite fermée en.... »