PRINCIPALES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ET EXEMPLES D'APPLICATION AU DIAGNOSTIC.
Publié le 02/04/2019
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Une électrophorèse en condition dénaturante (pour séparer les brins néosynthétisés de la matrice) est effectuée.
Le résultat peut être visualiser après autoradiographie car les brins néosynthétisés ont incorporé des nucléotides radioactifs.
4/ Applications.
- Diagnostic génotypique : détection de mutations dans le cas de maladies héréditaires.
- Oncologie : détection de remaniements chromosomiques.
- Médecine légale : empreintes génétiques, détections de polymorphismes.
- Pathologies infectieuses et parasitaires : détection de virus ou parasites.
C. Sondes et hybridation moléculaire.
1/ Définitions.
Hybridation moléculaire
Réaction au cours de laquelle des molécules d'acides nucléiques (ADN ou ARN) simple brin s'associent de façon stable et spécifique par complémentarité de bases (A-T, C-G)
Sonde
Fragment polynucléotidique défini complémentaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN cible, elle est marquée de manière radioactive (32P) ou avec des marqueurs « froids » (enzymes).
2/ Principe.
Cette technique permet la détection d'une séquence cible dans un mélange d'acide nucléique.
- De l'ADN complémentaire est produit à partir des ARNm purifiés. Ceci grace à la reverse transcriptase, enzyme qui est capaple de synthétiser de l'ADN à partir d'ARN.
- Une PCR est effectuée avec des amorces capables d'amplifier la séquence d'interêt.
- Les produits de PCR sont comparés.
E. La PCR ASO.
1/ Principe
- \"Allele-Specific Oligonucléotide hybridisation\".
Technique permettant de détecter et d'identifier des mutations connues.
Ceci avec une sonde spécifique de la région portant la mutation.
- PCR pour amplifier la région à étudier.
- Dépôt sur deux membranes des produits de PCR.
- Dénaturation.
- Hybridation de chacune des deux membranes avec une sonde marquée reconnaissant l'allèle muté ou l'allèle sauvage.
- Lavages.
- Révélation.
La sonde normale reconnaît spécifiquement l'allèle normal et la sonde mutée l'allèle muté.
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