Génétique fondamentale

« 1 Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Niveau L1 Année 2022-2023 UE GENETIQUE FONDAMENTALE Dr OKON A.J.L Msc PhD Laboratoire d’Histologie-Embryologie -Cytogénétique 2 INTRODUCTION • Intérêts: - diagnostic des anomalies chromosomiques - diagnostic prénatal des malformations congénitales - diagnostic de certaines infertilités - diagnostic des cancers 3 PLAN I.

Méthodes d’étude II.

Structure des acides nucléiques III.

Gènes IV.

Structure et fonction des chromosomes V.

Division cellulaire VI.

Cycle cellulaire 4 I : METHODES D’ETUDE 5 OBJECTIFS - Citer les méthodes de coloration du support génétique en microscopie optique (M.O) et en microscopie électronique (M.E) - Désigner les quatre techniques de marquage en bande des chromosomes 6 PLAN I.

VISUALISATION DE LA CHROMATINE 1.1 En microscopie optique 1.2 En microscopie électronique II.

VISUALISATION DES CHROMOSOMES 2.1 En microscopie optique 7 I : METHODES D’ETUDE I.

EN MICROSCOPIE OPTIQUE – Support génétique = molécules d’ADN – Colorants = affinité ADN et/ou protéines associées 8 I : METHODES D’ETUDE 1.

Visualisation de la chromatine (1) • Les colorants classiques (de routine) => Microscopes photoniques - L’hématoxyline - La réaction de Feulgen - Le Giemsa +++ 9 I : METHODES D’ETUDE 1.

Visualisation de la chromatine (2) • Les colorants fluorescents => Visualisent spécifiquement l'ADN => Microscopes à fluorescence - Moutarde de quinacrine - DAPI (4',6- diamino-2-phényl- indole) - Iodure de Propidium 10 I : METHODES D’ETUDE 2.

Visualisation des chromosomes (1) - Le Giemsa +++ - Les colorants fluorescents - Les bandes chromosomiques 11 Noyaux Hématie Microphotographie tissulaire colorée à l’hématoxyline (MO). L’hématoxyline colore plus fortement le noyau que le reste de la cellule : en bleu/violet. 12 Chromatine Chromosomes en mitose (ADN dupliqué) Microphotographie de frottis cellulaire coloré après la Réaction de Feulgen (MO). La réaction est spécifique de la molécule d’ADN qui est rose (l’intensité du rose permet d’estimer la quantité d’ADN).

Les nucléoles (ARN) ne sont pas colorés. 13 Hématie Noyau d’1 lymphocyte (Giemsa) Chromosomes métaphasiques (Giemsa) La chromatine et les chromosomes sont colorés en rose violacé. Le Giemsa est le colorant de base de tous les chromosomes. 14 Coloration par la moutarde de quinacrine Coloration par le DAPI Coloration par l’iodure de Propidium TROIS MICROPHOTOGRAPHIES DE CHROMOSOMES MÉTAPHASIQUES OBSERVÉS EN MICROSCOPIE À FLUORESCENCE. 15 . I : METHODES D’ETUDE II.

EN MICROSCOPIE ÉLECTRONIQUE • Visualisation des ultrastructures => Organites intracytoplasmiques, membranes cellulaires, endomembranes… => Non observables en microscopie optique. 16 Microscopie électronique à balayage Neurone Fibre musculaire Ultramicrophotographie de la Jonction neuro-musculaire MEB X15000 17 Microscopie électronique à transmission Ultramicrophotographie de l’épithélium trachéal : MET X 15000 Contraste au glutaraldéhyde et post fixation au tétraoxyde d'osmium (acide osmique) 18 I : METHODES D’ETUDE III.

CARYOTYPE HUMAIN 1.

Historique 1865, Mendel met en évidence l’hérédité des caractères transmis. 1953, Crick et Watson décrivent la structure en double hélice de l’ADN. 1956, Tijo et Levan détermine le nombre des chromosomes humains. Depuis 1959, le passage d’une médecine clinique descriptive au diagnostic cytogénétique des pathologies a permis au caryotype classique, l’analyse de référence en cytogénétique par le premier cas de trisomie 21 diagnostiqué. 19 I.

GÉNÉRALITÉS 1.

Historique (suite) Le caryotype permet de réaliser une étude pangénomique, permettant une analyse globale du génome.

En colorant les chromosomes et en les classant selon la taille et la position du centromère, il a été possible de décrire les anomalies de nombre des chromosomes et les remaniements de grande taille. En 1970, la cytogénétique connaitra un nouvel essor grâce aux techniques de marquage chromosomique, permettant d’analyser la structure des chromosomes sous forme de séquences de bandes par dénaturation par la trypsine (bandes G) ou par la chaleur (bandes R). 20 21 I.

GÉNÉRALITÉS 2.

Technique d’obtention d’un caryotype Principe: Obtenir un maximum de cellules bloquées en métaphase. • Caryotype constitutionnel: étudie la constitution chromosomique de l’individu. • Caryotype prénatal : étudie la constitution chromosomique du fœtus. • Caryotype somatique médullaire: étudie la constitution chromosomique des cellules de la moelle osseuse. • Caryotype somatique tumoral étudie la constitution chromosomique des cellules d’une tumeur maligne 22 I.

GÉNÉRALITÉS 3.

Culture cellulaire Elle se fait dans un milieu de culture adapté (exemple le Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)). 4.

Blocage des cellules en métaphase Afin d’observer les chromosomes en métaphase, on utilise du poison du fuseau de division.

Classiquement c’est la Colchicine ou la Colcémide. 23 24 I.

GÉNÉRALITÉS 5.

Choc hypotonique Les cellules sont plongées dans une solution hypotonique de chlorure de potassium (KCl) ce qui entraine leur gonflement suivi d’éclatement de membrane nucléaire et dispersion des chromosomes. 25 I.

GÉNÉRALITÉS 6.

Fixations, étalement et vieillissement -Fixation au Carnoy acétique ( mélange d’alcool et d’acide acétique). Après fixations et lavages, le culot chromosomique sert pour l’étalement des métaphases sur lames de verre. - Étalement de 1 à 4 gttes de suspension cellulaire sur une lame propre par une pipette pasteur .

Les lames sont séchées à l’air libre puis à l’étuve à 37°C pour parfaire la fixation et une meilleure dénaturation c’est le vieillissement. 26 I.

GÉNÉRALITÉS 7.

Coloration Plusieurs techniques de colorations (Giemsa, Bleu de méthylène, Bleu de toluidine, Quinacrine, Iodure de propidium, Di Amino –Phényle- Indole (DAPI)) sont utilisées pour l’obtention de cette coloration homogène des chromosomes. 8.

Dénaturation et Coloration -Coloration au Giemsa permet de distinguer la taille et la forme des chromosomes mais pas suffisantes pour interprétation correcte des anomalies chromosomiques. 27 Moutarde de Quinacrine DAPI Iodure de Propidium 28 I.

GÉNÉRALITÉS 9.

Dénaturation et Coloration (suite) -Reconnaissance des paires de chromosomes par marquage en succession de bandes sombres et claires appelée coloration en bande ou « banding ».

Il existe différentes techniques de banding: - bandes G, R, C, NOR. 29 I.

GÉNÉRALITÉS 9.

Dénaturation et Coloration (suite) -Le bandes G ( G = Giemsa): obtenues après digestion trypsinique modérée des chromosomes puis coloration au Giemsa. -Les bandes R (R pour Reverse): obtenues par dénaturation thermique ménagée à 85°C suivie d’une coloration au Giemsa.

Elle marque les télomères en sombre à l’inverse des bandes G et Q avec lesquelles les télomères sont pâles.

Révèle les paires G-C. 30 I.

GÉNÉRALITÉS 9.

Dénaturation et Coloration (suite) -Bande C (centromérique): coloration par le Sulfate de Baryum permet de mettre en évidence l’hétérochromatine constitutive, qui correspond à des régions non codantes du génome comme les centromères de tous les chromosomes, les régions juxta-centromériques des chromosomes 1,9 et 16 ainsi que la moitié distale du bras long du chromosome Y. -NOR (Nucleolar Organizer Region): dépôt de Nitrate d’argent qui met en évidence les organisateurs nucléolaires codant pour les ribosomes. 31 Chromosomes doubles métaphasiques G = bandes G ; R = bandes R 32 Caryotype (46, XX) : chromosomes doubles métaphasiques colorés par le sulfate de baryum = bandes C 33 Chromosomes doubles métaphasiques et chromatines après imprégnation des organisateurs nucléolaires par le Nitrate d'argent Bandes NOR 34 II.

STRUCTURE DES ACIDES NUCLÉIQUES ET EXPRESSION DES GÈNES 35 1.

Acides nucléiques et polypeptides Dogme de la biologie moléculaire - ADN ARN PROTEINE - Processus unidirectionnel. - Transcription: ADN matrice de synthèse de nombreux types d’ARN par une ARN polymérase - Traduction: ARNm décodé pour synthétiser un polypeptide au niveau des ribosomes 36 1.

Acides nucléiques et polypeptides Dogme de la biologie moléculaire -Séquence linéaire d’ADN décodée par groupes de triplets de nucléotides enfin de former des séquences linéaires de nucléotides d’ ARN. - Séquence nucléotide d’ARN décodée par triplets de codons pour former une séquence linéaire d’acides aminés dans le polypeptide produit. 37 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • ADN et ARN sont des polymères possédant un long squelette composé alternativement de résidus phosphate et d’un sucre à 5 carbones attaché à une base d’azote. • Bases purines (Adénine, Guanine) possèdent 2 cycles accolés • Bases pyrimidines (Cytosine, Thymine, Uracile) possèdent qu’un seul cycle. 38 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques 39 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • Sucre ADN = désoxyribose. • Sucre ARN = ribose . • ADN 4 types de bases : Adénine, Cytosine, Guanine, Thymine. • ARN 4 types de bases: Adénine, Cytosine, Guanine, Uracile • Nucléoside= Base +Ose • Nucléotide= Nucléoside + Phosphate 40 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • Nomenclature des nucléosides et nucléotides - Cas des purines: BASE NUCLEOSIDE NUCLEOTIDE Adénine Adénosine (ribose) Adénosine monophosphate (AMP) Désoxyadénosine Désoxyadénosine monophosphate ( dAMP) (désoxyribose) Adénosine diphosphate (ADP) Désoxyadénosine diphosphate ( dADP) Adénosine triphosphate (ATP) Désoxyadénosine triphosphate ( dATP) 41 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • Nomenclature des nucléosides et nucléotides - Cas des purines: BASE NUCLEOSIDE Guanine Guanosine (ribose) Guanosine monophosphate (GMP) Désoxyguanosine Désoxyguanosine monophosphate ( dGMP) (désoxyribose) NUCLEOTIDE Guanosine diphosphate (GDP) Désoxyguanosine diphosphate ( dGDP) Guanosine triphosphate (GTP) Désoxyguanosine triphosphate ( dGTP) 42 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • Nomenclature des nucléosides et nucléotides - Cas des pyrimidines BASE NUCLEOSIDE NUCLEOTIDE Cytosine Cytidine (ribose) Cytidine monophosphate (CMP) Désoxycytidine Désoxycytidine monophosphate ( dCMP) (désoxyribose) Cytidine diphosphate (CDP) Désoxycytidine diphosphate ( dCDP) Cytidine triphosphate (CTP) Désoxycytidine triphosphate ( dCTP) 43 1.

Acides nucléiques et polypeptides Acides nucléiques • Nomenclature des nucléosides et nucléotides - Cas des pyrimidines.... »